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基于單分子層技術(shù)研究哈維氏弧菌磷脂酶D對不同磷脂底物的吸附動(dòng)力學(xué)——材料與方法
來(lái)源:中國油脂 瀏覽 3 次 發(fā)布時(shí)間:2024-07-29
磷脂酶D(Phospholipase D,PLD)(EC 3.1.4.4)是一類(lèi)能水解磷脂質(zhì)生成磷脂酸和羥基化合物的酶。除了具有水解活性外,PLD還可通過(guò)磷?;D移作用催化磷脂質(zhì)極性頭部基團的轉移反應,從而將大量磷脂酰膽堿(PC)催化合成為自然界稀有的磷脂質(zhì),如磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰絲氨酸(PS)、磷脂酰甘油(PG)等。合成的磷脂質(zhì)在食品、化妝品、藥品中具有重要應用價(jià)值。目前,磷脂酶D已成為合成和改造磷脂質(zhì)的重要工具。從催化反應過(guò)程看,無(wú)論是催化磷脂質(zhì)水解反應還是磷?;D移反應,由于磷脂酶D的反應底物是不溶于水的磷脂,因此與脂肪酶類(lèi)似,磷脂酶D也屬于界面酶。界面酶催化水解反應的進(jìn)程大致可分為兩步,首先水中游離的酶蛋白在脂質(zhì)底物存在的條件下,從水相聚集到“脂質(zhì)-水界面”上。其次,脂質(zhì)底物進(jìn)入酶蛋白催化活性中心,發(fā)生相應的催化反應,生成目的產(chǎn)物。已有研究表明,“磷脂質(zhì)-水界面”的存在以及界面的質(zhì)量對于磷脂酶D活力的充分發(fā)揮具有重要影響。而界面吸附作為酶催化反應的首要步驟,在該過(guò)程中發(fā)揮著(zhù)重要作用。但目前對于磷脂酶D而言,大部分研究集中在利用其進(jìn)行特定結構磷脂的合成,對于酶蛋白對脂質(zhì)界面吸附特性的研究鮮有報道。
來(lái)源于哈維氏弧菌的磷脂酶D是新發(fā)現的一種酶,目前對于該酶的酶學(xué)特性尤其是該酶對不同磷脂底物的吸附動(dòng)力學(xué)尚未見(jiàn)有相關(guān)報道。單分子層膜是目前公認的研究酶蛋白與脂質(zhì)相互作用的經(jīng)典模型?;趩畏肿訉蛹夹g(shù)可實(shí)現脂質(zhì)單分子層-水界面特性的精準控制,從而為分子水平研究酶蛋白在磷脂質(zhì)-水界面上的吸附動(dòng)力學(xué)奠定基礎。本研究首次利用單分子層技術(shù)研究該酶對不同磷脂底物的吸附動(dòng)力學(xué),以期深入了解該酶的界面吸附特性以及針對該酶進(jìn)行開(kāi)發(fā)與應用。
1材料與方法
1.1實(shí)驗材料
1.1.1原料與試劑
L-α-磷脂酰膽堿(≥97%)、L-α-磷脂酰肌醇(≥99%),L-α-磷脂酰絲氨酸(≥97%),L-α-磷脂酰乙醇胺(≥99%),L-α-磷脂酰甘油(≥98%),均購于Sigma公司;氨芐抗生素、pET21a表達載體、誘導劑IPTG,均購于Invitrogen公司;質(zhì)粒提取試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒,購于上海生工生物工程有限公司。其他試劑均為分析純。
1.1.2儀器與設備
葡聚糖凝膠G-25柱(1 000~5 000 Da,1 cm×20 cm,GEHealthcare Bio-Science AB),Q柱(5 mL預裝柱,嫁接葡聚糖的Seplite 6FF,配體—CH2N+(CH3)Cl-,粒徑50~150μm,流速300~500 cm/h,工作溫度4~40℃,pH范圍2~12,儲存緩沖液20%乙醇,溫度4~8℃),HYG-C型恒溫振蕩培養箱,JY92-IIN超聲破碎儀,Biologic LP蛋白層析儀(Bio-Rad公司),ELx800酶標儀(BioTek公司),Micro TroughX LB膜分析儀(配備有界面吸附專(zhuān)用反應槽,芬蘭Kibron公司),DTCZ-240N SDS-PAGE電泳儀,Triple TOF 5600 LC-MS質(zhì)譜儀(美國AB SCIEX公司)。
1.2實(shí)驗方法
1.2.1失活型哈維氏弧菌磷脂酶D大腸桿菌重組表達菌株的構建
首先,從NCBI蛋白數據庫中下載哈維氏弧菌磷脂酶D的完整蛋白序列(GenBank:WP_005435673.1)。用在線(xiàn)信號肽分析軟件SignalP 4.1 server對其信號肽進(jìn)行分析預測。去掉N端24個(gè)信號肽氨基酸后的蛋白序列稱(chēng)為成熟蛋白序列。編碼磷脂酶D成熟蛋白(VhPLD)的基因序列委托上海生工生物工程有限公司參照大腸桿菌密碼子偏好性進(jìn)行優(yōu)化,同時(shí)在優(yōu)化的基因序列N端和C端分別添加NdeI和XhoI酶切位點(diǎn)并進(jìn)行全基因序列的合成。合成的VhPLD基因用NdeI和XhoI內切酶酶切后連入用相同內切酶進(jìn)行酶切的pET21a表達載體。將構建的質(zhì)粒pET21a-VhPLD轉化大腸桿菌DH 5α感受態(tài)細胞并進(jìn)行測序驗證。為了避免酶水解磷脂從而對酶蛋白的吸附過(guò)程研究造成干擾,在已經(jīng)構建的pET21a-VhPLD表達載體的基礎上進(jìn)一步引入針對催化活性位點(diǎn)His157的單點(diǎn)突變(H157A),從而使表達酶蛋白喪失水解活性。單點(diǎn)突變體的構建采用重疊延伸法進(jìn)行。將構建的突變體pET21a-VhPLD-H157A轉化大腸桿菌DH 5α感受態(tài)細胞并進(jìn)行測序驗證。將測序正確的質(zhì)粒進(jìn)一步轉化到E.coliShuffleT7感受態(tài)細胞中,陽(yáng)性克隆鑒定成功后,獲得失活型哈維氏弧菌磷脂酶D的大腸桿菌重組表達菌株。
1.2.2失活型VhPLD的表達與純化
將重組表達菌株接種于5 mL含有氨芐抗生素的LB液體培養基(0.5%酵母提取物,1%蛋白胨,1%NaCl)中,37℃下過(guò)夜培養,制備種子液。按5%接種量接種放大于含有氨芐抗生素的LB液體培養基中,37℃、200 r/min下培養2~3 h至OD600為0.6~0.8,加入誘導劑IPTG,至終濃度為0.05 mmol/L。調整培養溫度到20℃,繼續發(fā)酵培養24 h。將誘導表達后的發(fā)酵菌液離心(8 000 r/min,6 min,4℃),去上清液,菌體用50 mmol/L Tris-HCl、100 mmol/L NaCl(pH 8.0)重懸,超聲破碎15 min,離心(10 000 r/min,15 min,4℃),收集破碎上清,用0.45μm濾膜過(guò)濾。將收集到的破碎上清液進(jìn)行Ni2+親和層析。蛋白上樣后,用Buffer A(50 mmol/L Tris-HCl,100 mmol/L NaCl,pH 8.0)沖洗,緊接著(zhù)用Buffer B(含有100~500 mmol/L咪唑的Buffer A)進(jìn)行梯度洗脫,收集出峰的蛋白樣品。將100 mmol/L咪唑梯度洗脫收集的出峰樣品用G-25柱脫鹽后,上樣Q柱陰離子交換層析,最終用含有300 mmol/L氯化鈉的緩沖液(50 mmol/L Tris-HCl,pH 8.0)洗脫得到目的蛋白樣品。所得到的蛋白樣品經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測其純度,用BCA蛋白定量檢測試劑盒測定其蛋白濃度,用Triple TOF 5600 LC-MS(AB SCIEX)質(zhì)譜儀進(jìn)行LC-MS/MS鑒定分析。
1.2.3 VhPLD對不同磷脂單分子層吸附動(dòng)力學(xué)參數測定